AW系列全自動工(gōng)作站(zhàn)是根據Western Blot實驗需要(yào)，通過儀器代替繁瑣、重複(fú)、枯燥的人工試驗。AW-12是捷美自主研發的一款全自動化的Western Blot操作系統，自動化實現制(zhì)冷低溫儲(chǔ)存、封閉、孵(fū)育、洗膜、回收一抗和二抗的整套流程。數控操作流程可避免手工的操作(zuò)誤(wù)差，降(jiàng)低背景，提高信噪比(bǐ)和(hé)相對靈敏度，确保(bǎo)同批(pī)次和不同批次間實驗(yàn)的可重(zhòng)複性。

1 實驗目的

AW-12全自動清洗工作站應用，進行手工和(hé)儀器處理的(de)效果對比，驗證儀器使用的可靠性。

2 實驗(yàn)原理(lǐ)

蛋白質印迹法（免疫印迹試(shì)驗(yàn)）即Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法(fǎ)。其基本原理是通過特異性抗(kàng)體對凝膠電泳處理過的細胞或生(shēng)物組織樣(yàng)品進行着色。通過分析着色的(de)位置和着色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。

3 實驗準(zhǔn)備(bèi)

3.1 實驗試劑

3.2 實驗(yàn)儀器

3.3 樣品制備(bèi)

3.3.1 細胞準備（293T細胞爲例）

3.3.1.1 細胞複蘇

将凍存的細胞從液氮中取出，并立即放入37℃水浴中，左右晃(huǎng)動(dòng)凍存管(guǎn)直至管内液體全部融解。然後将液體加入裝(zhuāng)有 9mL 培養基的離心(xīn)管中，立即混勻。離心4℃，300×g，5min。棄去上清，細胞沉澱用10% FBS、5ml 雙抗（青(qīng)黴素10000U/ml，鏈黴素10000U/mL）的DMEM高糖(táng)完全(quán)培養基懸浮後轉(zhuǎn)入培養瓶中(zhōng)，最後(hòu)将細胞培(péi)養瓶放進37℃，5% CO2 培養箱培養。

3.3.1.2 細胞培養

293T細胞DMEM高糖完全培養基培養，置于37℃，5% CO2 飽和濕度培養箱内，當293T細胞生長至培養(yǎng)皿底(dǐ)部(bù)90%左右時傳代，用含有0.25%胰酶的細胞消化液消化，消(xiāo)化一段時間後用含有血清的完全培養基終止，傳代或鋪闆。待細胞處于對數生長期時進行實驗。

3.3.2 蛋白裂解(jiě)

（1）從細胞房CO2培養箱中取(qǔ)出細胞拿回實驗室進行操作。

（2）用移液器吸取細胞培養皿中的細胞(bāo)培養液棄去，每個細胞培養皿中加入預冷的PBS 清洗一遍，棄去PBS。（一定要吸淨，否則會影(yǐng)響蛋白的(de)濃度(dù))。加入适量的細(xì)胞裂(liè)解液進行裂解（10cm 細胞培養皿中大約加500μl），輕輕搖晃均勻。

（3）冰上裂解20分鍾。

（4）裂(liè)解後(hòu)的細胞小心的用移液槍吹打，盡量不要吹出氣泡。吸取液體，置于預先标記好的EP管中，在冷凍離心機中12000×g離心15分鍾（全部操作都要在冰上進行，冷凍離心機要(yào)提前預冷)。

（5）吸取(qǔ)離心後的上清液轉移至預先标記好的新(xīn)的EP管中，注意不要吸到沉澱，可以用冷凍離心機瞬離，保證沒有(yǒu)氣泡(pào)。進行下一步處理或保存于-80℃冰(bīng)箱。

3.3.3 煮樣

利(lì)用BCA試劑盒測蛋白樣品的濃(nóng)度，并将其總蛋白濃度制成3mg/ml，加5×loading buffer振蕩混(hùn)勻後，置于100℃金屬浴中(zhōng)10min，蛋白變(biàn)性，制好的蛋白樣待上樣或保存在-20℃。