aw系(xì)列全自動(dòng)工作站是根據western blot實驗(yàn)需要，通(tōng)過儀器(qì)代替(tì)繁瑣、重複(fú)、枯燥的人(rén)工試(shì)驗。aw-12是捷美自主(zhǔ)研發的一(yī)款全自動(dòng)化(huà)的western blot操作系統，自動化實(shí)現制冷低溫儲(chǔ)存、封閉、孵(fū)育、洗膜、回收一抗和(hé)二抗(kàng)的(de)整套流(liú)程。數控操作流(liú)程可避免手(shǒu)工(gōng)的操作誤差，降(jiàng)低背(bèi)景(jǐng)，提高信(xìn)噪比和相對靈(líng)敏度，确保(bǎo)同批(pī)次和不同批(pī)次(cì)間實(shí)驗的可重(zhòng)複性(xìng)。

1 實驗目的(de)

aw-12全自動清洗工作站應用，進行(háng)手工和(hé)儀(yí)器處(chù)理的效果對比，驗證儀器使用(yòng)的可靠性。

2 實驗(yàn)原理(lǐ)

蛋白(bái)質印迹法(fǎ)（免疫印迹(jì)試驗）即western blot。它是分子生(shēng)物學、生物(wù)化學和免疫遺傳(chuán)學(xué)中常用的(de)一種(zhǒng)實驗方法。其基本(běn)原理是(shì)通過(guò)特(tè)異(yì)性抗體對凝膠(jiāo)電泳(yǒng)處(chù)理過(guò)的(de)細胞(bāo)或生(shēng)物組織樣(yàng)品進行着(zhe)色。通(tōng)過分析着(zhe)色的(de)位置和着(zhe)色深(shēn)度獲得特定蛋(dàn)白質在所分(fèn)析(xī)的細胞或組織(zhī)中表達情況的信息(xī)。

3 實驗準備(bèi)

3.1 實驗試劑

3.2 實驗(yàn)儀器

3.3 樣品(pǐn)制備(bèi)

3.3.1 細胞準備(bèi)（293t細胞爲例）

3.3.1.1 細胞複蘇(sū)

将凍存(cún)的(de)細胞從液氮中取出(chū)，并立即放(fàng)入(rù)37℃水(shuǐ)浴中，左右(yòu)晃動(dòng)凍存管(guǎn)直(zhí)至管(guǎn)内液(yè)體(tǐ)全部融(róng)解(jiě)。然後将液體(tǐ)加入裝有 9ml 培(péi)養(yǎng)基的(de)離心管中(zhōng)，立即混(hùn)勻。離心(xīn)4℃，300×g，5min。棄去(qù)上清(qīng)，細胞(bāo)沉澱用10% fbs、5ml 雙抗（青(qīng)黴素10000u/ml，鏈黴素10000u/ml）的dmem高糖完全培養基懸浮(fú)後轉入培養瓶中，最後(hòu)将細胞培養瓶(píng)放進(jìn)37℃，5% co2 培養箱培(péi)養。

3.3.1.2 細胞培(péi)養

293t細(xì)胞dmem高糖(táng)完全培(péi)養基(jī)培養(yǎng)，置于(yú)37℃，5% co2 飽(bǎo)和濕度培養(yǎng)箱内，當293t細(xì)胞生(shēng)長至培養皿底(dǐ)部90%左右(yòu)時(shí)傳代，用含(hán)有0.25%胰(yí)酶的(de)細胞消化(huà)液消(xiāo)化，消化一段時(shí)間後用含(hán)有血(xuè)清的完全培養基終止(zhǐ)，傳代或(huò)鋪闆。待細胞處(chù)于對數(shù)生(shēng)長期(qī)時進(jìn)行(háng)實驗。

3.3.2 蛋(dàn)白裂解

（1）從細胞(bāo)房co2培(péi)養箱中取(qǔ)出細胞拿回實(shí)驗室進行操(cāo)作。

（2）用移液器(qì)吸取(qǔ)細胞培養皿中的細(xì)胞培養液(yè)棄去，每個細胞(bāo)培養皿中(zhōng)加入預冷的(de)pbs 清(qīng)洗一遍，棄去(qù)pbs。（一定要(yào)吸淨(jìng)，否則會影響蛋白的濃度(dù))。加入适量的細胞裂解液(yè)進行(háng)裂解（10cm 細胞培養(yǎng)皿中(zhōng)大約加500μl），輕輕搖晃均勻。

（3）冰(bīng)上裂解20分(fèn)鍾。

（4）裂解後的細(xì)胞小(xiǎo)心的用(yòng)移(yí)液槍(qiāng)吹打(dǎ)，盡量不要(yào)吹出氣泡(pào)。吸取(qǔ)液體(tǐ)，置于預先(xiān)标記(jì)好的ep管中，在冷凍離(lí)心機(jī)中12000×g離心15分鍾（全部(bù)操作(zuò)都要在(zài)冰上進(jìn)行(háng)，冷凍(dòng)離心機(jī)要提前(qián)預冷)。

（5）吸(xī)取離心後的(de)上清(qīng)液轉(zhuǎn)移(yí)至預先(xiān)标記(jì)好的新的(de)ep管中(zhōng)，注意不(bú)要(yào)吸到沉澱，可(kě)以用冷凍離(lí)心機瞬離，保證沒(méi)有(yǒu)氣泡(pào)。進行下一步處(chù)理或(huò)保存(cún)于-80℃冰(bīng)箱。

3.3.3 煮樣

利用bca試劑盒(hé)測蛋白樣(yàng)品的濃度(dù)，并将(jiāng)其總蛋(dàn)白濃(nóng)度(dù)制成(chéng)3mg/ml，加(jiā)5×loading buffer振(zhèn)蕩混(hùn)勻後，置(zhì)于(yú)100℃金屬(shǔ)浴中(zhōng)10min，蛋白(bái)變性(xìng)，制好(hǎo)的蛋(dàn)白樣(yàng)待上樣或(huò)保存在-20℃。