1 實(shí)驗背景

蛋(dàn)白質(zhì)印迹(jì)法（免疫印(yìn)迹試驗）即(jí)western blot。是分子生(shēng)物學、生物(wù)化學和(hé)免疫遺(yí)傳學等衆多學(xué)科領域中常用(yòng)的一種(zhǒng)檢(jiǎn)測特(tè)異蛋白質表達水平(píng)的實驗方(fāng)法(fǎ)，傳統手工方(fāng)法操作時(shí)間久(jiǔ)，結果(guǒ)穩(wěn)定性差(chà)，爲了解(jiě)決這些(xiē)問題，捷美(měi)自主(zhǔ)研發了一款aw-12全(quán)自動(dòng)清洗工作(zuò)站，代(dài)替(tì)繁瑣、重(zhòng)複、枯燥的手工(gōng)實驗(yàn)過程，自動(dòng)化(huà)實現制(zhì)冷低(dī)溫儲存(cún)、封閉(bì)、孵(fū)育、洗膜、回收一(yī)抗和二抗(kàng)的整套western blot孵(fū)育流程。實驗結(jié)果表明，aw-12的(de)顯影效果完(wán)全(quán)可以達(dá)到(dào)傳統(tǒng)手工得到的效果，而(ér)且(qiě)比傳統(tǒng)手工結果更穩定。

2 實(shí)驗目的

比(bǐ)較aw-12全自動(dòng)清洗工作站(zhàn)和傳統(tǒng)手工方法操作western blot實(shí)驗(yàn)得出的顯(xiǎn)影效果，驗(yàn)證儀(yí)器使(shǐ)用(yòng)的可靠(kào)性及(jí)穩(wěn)定性。

3 western blot

3.1 制膠

3.1.1 準備

先用試(shì)管刷蘸取(qǔ)洗潔(jié)精洗(xǐ)去玻璃(lí)闆(pǎn)上污漬，用自來水将闆上殘留(liú)的洗潔精(jīng)沖洗(xǐ)幹(gàn)淨，再用(yòng)蒸餾(liú)水沖洗；先将棉墊墊于(yú)配(pèi)膠闆(pǎn)上，玻(bō)璃闆對齊後放(fàng)入夾中卡(kǎ)緊(jǐn)，然後(hòu)垂(chuí)直卡在架子(zǐ)上，然(rán)後(hòu)向其中(zhōng)加(jiā)滿ddh2o靜(jìng)置5min，不漏，倒掉ddh2o,傾(qīng)斜制(zhì)膠(jiāo)闆晾幹(gàn)。

3.1.2 分離膠

按(àn)照表(biǎo)1配制8%分(fèn)離膠(jiāo)，振(zhèn)蕩混勻(yún)後(hòu)用1ml槍(qiāng)沿兩塊玻璃闆(pǎn)間的(de)一角緩慢(màn)加入下層膠，槍内膠(jiāo)不(bú)要一次(cì)性全部(bù)加(jiā)完，注意不能(néng)有(yǒu)氣泡，加至綠框下緣平(píng)行。最後在闆(pǎn)内加入無水乙(yǐ)醇，液封。室(shì)溫下等待30min，待下層膠(jiāo)完全凝(níng)固(gù)後，倒(dǎo)掉上(shàng)面的(de)無水(shuǐ)乙醇(chún)，傾斜(xié)制(zhì)膠(jiāo)闆晾(liàng)幹。

3.1.3 濃縮膠(jiāo)

準備(bèi)好(hǎo)梳子，按照表(biǎo)1配制濃縮(suō)膠振(zhèn)蕩混勻後(hòu)用移液槍加至(zhì)玻璃闆(pǎn)上緣，注(zhù)意不能産(chǎn)生氣(qì)泡。随從一(yī)側緩(huǎn)慢插入梳子，室溫下等待30分鍾(zhōng)，待上(shàng)層(céng)膠(jiāo)完全(quán)凝固。

3.2 點樣和電(diàn)泳

3.2.1

取下配(pèi)好的(de)膠置于電泳槽(cáo)内，從槽中間加入電泳緩沖液，中間倒滿沒過梳子，外面至相(xiàng)應刻度線(xiàn)即可(kě)。平行(háng)拔出梳(shū)子(zǐ)，用200ul移液槍吹孔(kǒng)，以保(bǎo)證孔内通(tōng)暢。按照marker 加2.5ul/孔，蛋(dàn)白樣品加10ul/孔。

3.2.2

蓋(gài)上電泳(yǒng)槽蓋子(zǐ)（注意(yì)正(zhèng)負極），電泳起(qǐ)始(shǐ)電壓爲70v，待其(qí)進入到分(fèn)離(lí)膠後調整電(diàn)壓至(zhì)90v跑(pǎo)至底部結束(shù)。

3.3 轉膜(mó)

3.3.1

在sds-page即将完成時，制備(bèi)轉膜液，準備好(hǎo)冰塊，先将轉膜(mó)液預制(zhì)冷(lěng)，剪取(qǔ)于凝(níng)膠大(dà)小相當的(de)pvdf膜一(yī)張及四張濾紙(zhǐ)，pvdf膜于(yú)甲醇中浸(jìn)泡2min左(zuǒ)右轉(zhuǎn)移至轉膜(mó)液中(zhōng)。濾紙(zhǐ)及海(hǎi)綿浸泡于(yú)轉膜(mó)液中(zhōng)備用(yòng)。

3.3.2

按照下面的(de)順序将(jiāng)膜與濾(lǜ)紙放置(zhì)在轉(zhuǎn)移(yí)裝置上：負極→黑色(sè)海綿→2張濾紙→凝膠→pvdf膜(mó)→2張濾

3.4 封閉(bì)和抗(kàng)體孵育

3.4.1 傳統手(shǒu)工方(fāng)法

3.4.1.1

封閉：準(zhǔn)備（貯備）好(hǎo)一個(gè)幹淨(jìng)的孵(fū)育盒(hé)，轉膜(mó)完成後，将(jiāng)pvdf膜完全(quán)置于封(fēng)閉液中（含5%脫脂(zhī)牛奶的pbst），然(rán)後将(jiāng)孵育(yù)盒放置于水平(píng)脫(tuō)色搖床(chuáng)上，轉(zhuǎn)速60，室(shì)溫封(fēng)閉1h。

3.4.1.2

洗膜：用pbst（含1%的tween-20）洗膜，轉速110，3次，5min/次(cì)。

3.4.1.3

一抗孵育：将pvdf膜(mó)根據所要目的(de)條帶進行(háng)剪(jiǎn)裁(cái)，然後(hòu)将其加入(rù)稀釋了适(shì)當濃度的(de)一抗（用2%bsa稀(xī)釋1:1000）中(zhōng)，放置在水(shuǐ)平脫色搖床上(shàng)，轉速(sù)60，将搖床放(fàng)進4oc冷(lěng)庫(kù)中孵育(yù)過夜(yè)。

3.4.1.4

洗膜(mó)：用pbst洗(xǐ)膜(mó)，轉(zhuǎn)速110，3次，10min/次。

3.4.1.5

二(èr)抗孵(fū)育：加入hrp标記的羊抗(kàng)鼠和羊抗兔(tù)的二抗(kàng)（5%脫脂(zhī)牛(niú)奶稀釋(shì)比(bǐ)例1：5000），置(zhì)于水平(píng)脫色搖床上，轉(zhuǎn)速60，室溫反應1h。

3.4.1.6

洗(xǐ)膜：用(yòng)pbst洗膜，轉速(sù)110，3次，10min/次(cì)。

3.4.1.7

最後(hòu)向孵(fū)育盒(hé)中加入pbst，将(jiāng)孵育(yù)盒放入(rù)4℃冰(bīng)箱中(zhōng)，等(děng)待(dài)顯影(yǐng)。

3.4.2 aw-12全自動清洗工作站(zhàn)的(de)方法

3.4.2.1

準備：

① 提前根據實驗需(xū)求準備好(hǎo)一抗、二(èr)抗試管，以及孵(fū)育盒，打(dǎ)開儀器開(kāi)關，預制冷。

②根據所選(xuǎn)擇孵(fū)育盒的規(guī)格準備(bèi)抗體的量（參(cān)見表2），然後(hòu)将一(yī)抗二抗抗(kàng)體(tǐ)加(jiā)入對應抗(kàng)體管中，并将(jiāng)抗(kàng)體管放進(jìn)對應的抗體儲存位置，孵育盒(hé)放進(jìn)孵育槽(cáo)中，手動(dòng)向孵(fū)育盒(hé)中加入5%脫脂牛奶（加(jiā)液量參(cān)見表2）。

③準備足量(liàng)ddh2o（洗針液(yè)）和(hé)pbst（清洗(xǐ)液）于相對應的桶中(zhōng)，及(jí)時倒掉(diào)廢液桶(tǒng)中的廢液，以免(miǎn)廢液溢出。

3.4.2.2

剪膜(mó)：轉膜完成(chéng)後，将(jiāng)pvdf膜根據所(suǒ)要的(de)目的條帶進行(háng)剪裁，并(bìng)将其放入對應的孵育盒中，蓋上(shàng)孵育盒蓋(gài)子。

3.4.2.3

程序設(shè)置：

根據孵育盒(hé)的選擇及所選擇的通道（1-12），在顯(xiǎn)示屏(píng)上點擊選(xuǎn)擇對應的通道(dào)和孵(fū)育盒的規(guī)格，儀器根(gēn)據所(suǒ)選的孵育盒規格提供了默認(rèn)參數（參見(jiàn)表2），如有需求可(kě)以更改參數(shù)。程序設(shè)置完成後，點擊屏幕(mù)上的“運行(háng)”，程序(xù)開始(shǐ)運行。

3.4.2.4

管路(lù)清(qīng)洗：

程序(xù)運行結束後，孵(fū)育盒(hé)始(shǐ)終保持低溫狀(zhuàng)态(tài)，手動(dòng)取出抗體(tǐ)管(guǎn)回(huí)收抗體，然後進(jìn)入管(guǎn)路清洗頁(yè)面點擊“管(guǎn)路清(qīng)洗”，開始清洗管(guǎn)路。

3.4.2.5

後續直接顯影就可關機并(bìng)把膜取(qǔ)出(chū)，若暫時不(bú)顯影可在運(yùn)行結束後，讓(ràng)儀器(qì)始終(zhōng)保(bǎo)持(chí)此狀(zhuàng)态(tài)，孵(fū)育盒(hé)及抗體儲存位(wèi)置始終保持低(dī)溫狀态。

3.5 顯影

将(jiāng)膜取出，置于暗盒中，将适量的(de)ecl發光液(yè)（1：1混勻後）均勻(yún)地加(jiā)到膜(mó)上，進行膠片曝(pù)光。壓片，并用(yòng)顯(xiǎn)影液和定(dìng)影液進行手工洗片，待膠片(piàn)風幹後(hòu)掃描記錄實驗(yàn)結果。

4 實驗結果與分析

從上面(miàn)顯影結果可以(yǐ)明顯(xiǎn)看(kàn)出(chū)，應用(yòng)aw-12全自動清(qīng)洗工(gōng)作站可以(yǐ)獲得清晰、低背(bèi)景的(de)結果，其效果完(wán)全可以達(dá)到或(huò)優于傳統手工(gōng)得到的(de)效果(guǒ)，并(bìng)且儀器可(kě)以節(jiē)省手工操作所(suǒ)花費的時間。

5 客(kè)戶試用提(tí)供顯(xiǎn)影結(jié)果圖