細胞培養在實(shí)驗完成後需要(yào)将細胞凍存存放起來，以便以後實驗需要，可以将凍存的細胞直接複蘇(sū)使用。然而爲了使複蘇得到的細胞狀态好，可直接用于實驗，細胞在凍存時的狀态就顯得尤爲重要，一定(dìng)要選擇細胞培養狀态好的時候将細胞凍存起來，其(qí)次(cì)是凍存細胞的方式和條件，凍存液的選擇等對細胞凍存都很重要。

下(xià)面簡(jiǎn)單介紹一下細胞凍(dòng)存方面的知識

一、什麽是細胞凍存？

細胞放在低溫環境，減少(shǎo)細胞代謝，以便長(zhǎng)期儲存。

二、細胞凍(dòng)存的具體操作步(bù)驟

1、配制含10%DMSO、90%胎牛血清的(de)凍存液或市面上購買(mǎi)的凍存液。

2、從培養箱取出(chū)細胞培養瓶（一般選擇處于對數期的細胞），轉移到超(chāo)淨台。棄去原(yuán)有培養液，用1-2mL PBS緩沖(chòng)液洗滌1次（注(zhù)意從側壁(bì)加入，以免(miǎn)沖掉細(xì)胞），棄去PBS緩沖液。

3、向培養瓶中加入1mL胰(yí)酶，消化，将加入胰酶(méi)的細胞培養瓶轉移(yí)到倒置(zhì)顯微鏡下觀察細(xì)胞消(xiāo)化情況，當(dāng)細胞變圓且大量脫落時(shí)，轉移到超(chāo)淨台(tái)。

4、加入2mL完全培養基，終(zhōng)止消化。用移液器充(chōng)分緩慢吹打，使細胞能夠完全脫落。然後将細胞懸液轉移至15mL離(lí)心管中，1000rpm/min離心5分鍾，轉移(yí)進超淨台，打開(kāi)蓋子，棄去上清。

5、加入适量凍存液，用(yòng)移液器輕輕吹打細胞團塊(kuài)，制備成細胞懸液，調節凍存液中細胞(bāo)密度，根據經驗按照(zhào)T25培養瓶一瓶凍存2-3管，将細胞分裝入凍存管中，每管1-1.5 ml。

6、在(zài)凍存管(guǎn)上标明細胞的(de)名稱，凍存時間(jiān)及操作(zuò)者。

7、将裝有細(xì)胞的凍存管放入4℃冰箱30min，後-20℃冰箱30min，然後(hòu)放入-80℃冰箱中過夜(yè)，取出凍存管，移入(rù)液氮容器(qì)内。或(huò)按照凍存液說明書操作。

注意(yì)事項

1.使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有(yǒu)滅菌的作用(yòng)。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構，以至于降低冷凍保護效果。在常(cháng)溫(wēn)下(xià)，DMSO對人體有害，故在配制時最好戴上手套操作。

2.細胞凍存注意要慢凍，按照溫(wēn)度梯度降溫法(fǎ)進行，不宜将凍存細胞放置(zhì)在0℃～-60℃這一溫度範圍(wéi)内過久，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度區内(nèi)，是“危險溫區”，實驗操作中(zhōng)可将(jiāng)細胞凍存管裝(zhuāng)在程序降溫盒(hé)中再放入-80℃冰箱，使(shǐ)之(zhī)以約1℃/min的降(jiàng)溫速(sù)度渡過“危險溫區”後保留在低溫冰箱或轉移至液氮罐。

3.注意定期檢查液氮(dàn)罐内液氮量，及時添加。