1 實驗背景

蛋白質印迹法（免疫印(yìn)迹試驗）即Western Blot。是分子生物學、生物(wù)化學和免疫遺傳學等衆多學科領域中(zhōng)常用的一種檢測特異蛋白質表達水平的實驗方(fāng)法(fǎ)，傳統手工方法操作時間久，結果穩定(dìng)性差，爲了解決這些問題，捷美自主研發了一款AW-12全自動清(qīng)洗工作站，代替繁瑣、重(zhòng)複、枯(kū)燥的手工實驗過程，自動化實現制冷低溫(wēn)儲存、封閉(bì)、孵(fū)育、洗膜、回(huí)收一(yī)抗和二抗的整套Western blot孵育流程。實驗結(jié)果表明，AW-12的(de)顯(xiǎn)影效果完全可以達到(dào)傳統手工得到的(de)效果，而且比傳統手工結果更穩定。

2 實驗目的

比較AW-12全自動(dòng)清洗工作站和傳統手工方(fāng)法(fǎ)操(cāo)作Western blot實驗(yàn)得出的顯影效果，驗證儀(yí)器使用的可靠(kào)性及穩定性。

3 Western Blot

3.1 制膠

3.1.1 準備

先用試管刷蘸取洗潔精洗去玻璃闆(pǎn)上污漬，用自來水将闆上殘留(liú)的洗潔精沖洗幹淨，再用蒸餾水沖洗；先将棉墊墊于(yú)配膠闆上，玻璃闆對齊後放入夾中(zhōng)卡緊，然後(hòu)垂直卡在架子上，然後(hòu)向(xiàng)其中加滿ddH2O靜置5min，不漏，倒掉ddH2O,傾斜制(zhì)膠闆晾幹。

3.1.2 分離膠

按照表(biǎo)1配制8%分離膠，振蕩混勻後用(yòng)1ml槍(qiāng)沿兩塊玻璃闆間的(de)一角緩慢(màn)加入下層膠，槍内膠不要一次性全部加完，注(zhù)意不(bú)能有氣泡，加至綠框下緣平行。最後在闆内加入無水乙醇，液(yè)封。室溫下等待30min，待下層膠完全凝固(gù)後，倒掉上面的無水乙醇，傾斜制膠闆晾幹。

3.1.3 濃縮膠

準備好梳子(zǐ)，按照表(biǎo)1配制濃縮膠振(zhèn)蕩混勻後用移液槍加至玻璃闆上緣，注意不能産生氣泡。随從一側緩慢插入梳子，室溫下等待(dài)30分鍾(zhōng)，待上層膠完全凝固。

3.2 點樣(yàng)和電(diàn)泳

3.2.1

取(qǔ)下配好的膠置于電泳槽内，從槽中間加入電泳緩沖液，中間倒滿沒過梳子，外面至相應刻度線即可。平行拔出梳子，用200ul移液槍吹孔，以保(bǎo)證孔内通(tōng)暢(chàng)。按照Marker 加2.5ul/孔，蛋白樣(yàng)品加10ul/孔。

3.2.2

蓋(gài)上電泳槽蓋子（注意正負(fù)極），電泳起始電壓(yā)爲70V，待其進入到分(fèn)離膠後調(diào)整電壓至90V跑至底部(bù)結束。

3.3 轉膜

3.3.1

在SDS-PAGE即将完成時，制備轉膜液，準備好冰塊，先将轉膜液預制冷，剪取于凝膠大小相當的PVDF膜一張及四(sì)張濾紙，PVDF膜于甲醇中浸泡2min左右轉移至轉膜液中。濾紙及海綿浸泡于轉膜液中備用。

3.3.2

按照下面的順序将膜與濾紙放置在(zài)轉移裝(zhuāng)置上：負極→黑色海綿→2張濾紙→凝膠→PVDF膜→2張濾

3.4 封閉和抗(kàng)體孵育

3.4.1 傳統手工方法

3.4.1.1

封(fēng)閉：準備（貯(zhù)備）好一個幹淨的孵(fū)育盒，轉膜完成(chéng)後(hòu)，将PVDF膜完全置于(yú)封閉液中（含5%脫脂(zhī)牛奶的PBST），然後将孵(fū)育盒放置于水平脫色搖床上，轉速60，室溫封閉1h。

3.4.1.2

洗膜：用(yòng)PBST（含1%的Tween-20）洗膜，轉(zhuǎn)速110，3次，5min/次。

3.4.1.3

一抗孵(fū)育：将PVDF膜根據所要目的條(tiáo)帶進行剪裁，然後将其加入稀釋了(le)适當濃度的(de)一抗（用2%BSA稀釋1:1000）中，放置在水(shuǐ)平脫色搖床上，轉速60，将搖(yáo)床放進4oC冷(lěng)庫中孵育過夜。

3.4.1.4

洗膜：用PBST洗膜，轉速110，3次，10min/次。

3.4.1.5

二抗孵育：加入HRP标記的羊抗鼠和羊抗兔的二抗（5%脫脂牛奶稀釋(shì)比例1：5000），置于水平脫色(sè)搖床上，轉速60，室溫反(fǎn)應1h。

3.4.1.6

洗膜：用PBST洗膜(mó)，轉速(sù)110，3次，10min/次。

3.4.1.7

最後向孵(fū)育盒(hé)中加入PBST，将孵育盒放入4℃冰箱中，等待顯影(yǐng)。

3.4.2 AW-12全自(zì)動清洗工作站的方法

3.4.2.1

準備：

① 提前(qián)根(gēn)據實驗需求準備好一抗(kàng)、二抗試管，以及孵育盒，打開儀器開(kāi)關，預制冷。

②根據所選擇孵育盒的規格準備抗(kàng)體的量（參見表(biǎo)2），然後将一抗二抗抗(kàng)體加入對應抗體管中(zhōng)，并将抗體管放進對應的抗體儲存位(wèi)置，孵(fū)育盒放進孵育槽中，手動(dòng)向孵育盒中加(jiā)入5%脫脂牛奶（加(jiā)液量參見表2）。

③準備足量ddH2O（洗針液）和PBST（清洗液）于相(xiàng)對應的(de)桶中，及(jí)時倒掉(diào)廢液桶(tǒng)中的廢液，以免(miǎn)廢液溢出。

3.4.2.2

剪膜：轉膜完成後，将PVDF膜根(gēn)據所要的目的(de)條帶進行(háng)剪裁，并将(jiāng)其放入對(duì)應的孵(fū)育盒中，蓋上孵育盒蓋子。

3.4.2.3

程(chéng)序設置：

根據孵(fū)育盒的選擇及所選擇的通道（1-12），在顯(xiǎn)示(shì)屏上點擊選擇對應(yīng)的通道和(hé)孵(fū)育盒(hé)的規格，儀器根據所選的孵(fū)育盒規格提(tí)供了(le)默認參數（參(cān)見表2），如有需求可(kě)以更改參數。程序(xù)設置完成後，點擊屏幕上的“運行(háng)”，程序開始運行。

3.4.2.4

管路清洗：

程序(xù)運行結束後，孵育盒始終(zhōng)保持低溫狀态，手動取出(chū)抗體管(guǎn)回(huí)收抗體，然後進入管路清(qīng)洗頁(yè)面點擊“管路清洗”，開始清洗管(guǎn)路。

3.4.2.5

後續直接(jiē)顯影就可關機并(bìng)把膜取出，若暫時不顯影可在(zài)運行結束後，讓儀器始終保持此狀态，孵育盒及抗體儲(chǔ)存位置始終保(bǎo)持(chí)低溫狀态。

3.5 顯影

将膜取出，置于暗盒中，将适量的(de)ECL發光(guāng)液（1：1混勻後）均勻地加到膜上，進行膠(jiāo)片曝光。壓(yā)片，并用顯(xiǎn)影液和定(dìng)影液進行手工洗片，待膠片風幹後掃描記錄實驗結果。

4 實驗結果與分析(xī)

從上面(miàn)顯影結果可以明顯看出，應用(yòng)AW-12全自動清洗工作站可以獲得清晰、低背景(jǐng)的結果，其效果完全可以達(dá)到或優于傳統手(shǒu)工(gōng)得到的效果，并(bìng)且儀器(qì)可以節省手工操作所花費的時間。

5 客戶試用提供顯影結果圖